Het gebruik van een 5-kanaals thermocycler PCR real-time qPCR PCR omvat de volgende stappen:
1. Monsterbereiding: extraheren DNA of RNA uit het biologische monster van interesse. Dit kan worden gedaan met behulp van verschillende methoden zoals fenol-chloroformextractie, op kolom gebaseerde zuivering of op magnetische bead-gebaseerde zuivering. 2. Primer- en sondeontwerp: ontwerpspecifieke primers en sondes die binden aan de doelsequentie van interesse. Deze primers en sondes worden meestal ontworpen met behulp van softwaretools die rekening houden met factoren zoals smelttemperatuur, GC -inhoud en specificiteit. 3. PCR -reactieopstelling: Bereid het PCR -reactiemix voor door het DNA- of RNA -sjabloon, primers, sondes en andere noodzakelijke componenten zoals nucleotiden, buffer en polymerase te combineren. Het reactiemix wordt vervolgens verdeeld in de putten van de PCR -plaat. 4. Thermocycling: plaats de PCR-plaat in de 5-kanaals thermocycler, die tegelijkertijd meerdere monsters kan herbergen. De thermocycler gaat dan door een reeks temperatuurcycli, waaronder denaturatie, gloeien en extensie, om de doel -DNA of RNA -sequentie te versterken. 5. Real-time monitoring: de 5-kanaals thermocycler is uitgerust met fluorescentiedetectiemogelijkheden. Tijdens elke temperatuurcyclus detecteert de thermocycler de fluorescentie die wordt uitgestoten door de gelabelde sonde omdat deze bindt aan het versterkte DNA of RNA. Dit zorgt voor realtime monitoring van het versterkingsproces. 6. Gegevensanalyse: de realtime fluorescentiegegevens worden verzameld en geanalyseerd met behulp van gespecialiseerde software. De software berekent de cyclusdrempelwaarde (CT) -waarde, die het cyclusnummer vertegenwoordigt waarbij het fluorescentiesignaal een vooraf gedefinieerde drempel overschrijdt. De CT -waarde wordt gebruikt om de initiële hoeveelheid doel -DNA of RNA in het monster te kwantificeren. 7. Gegevensinterpretatie: de CT-waarden verkregen uit de 5-kanaals thermocycler kunnen worden vergeleken tussen verschillende monsters of experimentele omstandigheden. Dit zorgt voor de kwantificering van genexpressieniveaus, detectie van specifieke mutaties of genetische variaties of meting van virale belasting, naast andere toepassingen. Over het algemeen is de 5-kanaals thermocycler PCR real-time qPCR PCR een krachtig hulpmiddel voor verschillende moleculaire biologietoepassingen, wat een snelle en nauwkeurige kwantificering van nucleïnezuren biedt.
